Отыскание антигена после электрофореза смеси белков

Биология » Аффинные иммуносорбенты. Использование радиоактивных изотопов » Отыскание антигена после электрофореза смеси белков

Это - еще один весьма полезный вариант использования иммуноспецифического связывания антител с их антигенами. Представим себе, что после разделения смеси белков электрофорезом в ПААГ получается большое число белковых полос, из которых одна должна содержать искомый белок.

Здесь можно использовать сочетание избирательности иммуноспецифического связывания с очень чувствительным способом использования радиоактивности. Интересующим исследователя белком иммунизируют кролика и очищают из его крови антисыворотку. Разработана и имеется в продаже специальная, так называемая "диазобумага".

Она обладает способностью по своим активным диазогруппам ковалентной химической связью присоединять любые белки.

По окончании электрофореза с верхней поверхности геля фильтровальной бумагой удаляют избыток влаги и кладут на него диазобумагу, зафиксировав ее положение на геле проколами по двум углам бумаги и геля. Потом эту пару, гелем вниз, помещают в систему "блоттинга", для переноса ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр.

То есть кладут гель на лист толстой фильтровальной бумаги, постоянно смачиваемой буфером, а на диазобумагу накладывают стопку фильтровальной бумаги и через пластинку стекла прижимают грузом. Током жидкости, идущей вверх по капиллярам, часть белков из каждой полосы переносится на диазобумагу и там прочно фиксируется.

Неиспользованные диазогруппы между белковыми "репликами" закрывают вымачиванием в 10% -ном растворе этаноламина, который в отношениях с диазогруппой имитирует белок. Затем диазобумагу помещают в раствор полученной ранее антисыворотки и выдерживают 12 часов при 37°С.

За это время завершается реакция связывания специфических антител, имеющихся в антисыворотке с фиксированным на бумаге антигеном. (Для всех остальных белков в антисыворотке, - даже суммарной, - нет специфических антител) Оставшиеся свободными антитела отмывают буфером.

Наконец, диазобумагу, на которой имеется реплика искомого белка вместе со связавшимися с ним антителами, инкубируют 2 часа при 37°С в растворе меченого радиоактивным йодом белка А (он доступен в виде готового препарата).

Не сорбированный на "стержнях" антител белок А отмывают крепким солевым раствором. Бумагу сушат и методом авторадиографии (описанным в следующей главе) на рентгеновской пленке локализуют положение полосы искомого белка. Для последующего правильного совмещения пленки с диазобумагой (а через нее и с гелем), на бумаге перед авторадиографией делают две пометки радиоактивными чернилами.


Другое по теме:

Безопасность применения пищевых, технологических и биологически активных добавок
Пища, необходимая для нормального функционирования человеческого организма, состоит из основных пищевых веществ – органических и неорганических соединений, которые требуются для нормального роста, поддержания и восстановления тканей, а та ...

Излучение абсолютно чёрного тела и кванты Планка
Слово “квант” впервые произнёс Макс Планк в 1900 г. До этого Планк четыре года безуспешно пытался решить проблему излучения абсолютно чёрного тела. Суть её в следующем. Свет, как и прочие электромагнитные волны, излучается по двум причина ...

Электрические явления в возбудимых тканях
Классификация: Биопотенциалы – общее название всех видов электрических процессов в живых системах. Потенциал повреждения – исторически первое понятие об электрической активности живого (демаркационный потенциал). Это разность потенциа ...