Аффинные иммуносорбенты
Страница 2

Самое важное для нас то обстоятельство, что все четыре домена "стержня" и ближние к нему пары доменов "ветвей" неизменны по своему аминокислотному составу и строению у всех антител ("константная часть").

И только две пары концевых доменов представляют собой вариабильную часть антитела, определяющую его антигенную специфичность. В этих доменах есть участки, которые именуются "гипервариабильными областями" (на рис. - заштрихованы).

В них различия антител, специфичных для различных антигенов, особенно ярко выражены. В каждой паре концевых доменов они образуют некое подобие "ущелья".

Можно ожидать, что именно здесь связывается антиген. Такое предположение нашло прямое подтверждение после того, как удалось кристаллизовать концевой фрагмент одного из антител вместе со связанным с ним антигеном (витамином К).

Анализ рентгенограммы показал, что молекула витамина лежит в "ущелье" области узнавания и различные ее части сближены и взаимодействуют с определенными аминокислотами в гипервариабильной области.

На рис. изображена пространственная конфигурация одного из вариабильных концевых доменов IgGl. Полипептидная цепочка из 104 аминокислот свернута так, что три ее заштрихованных (гипервариабильных) участка выходят на поверхность домена примерно в одной плоскости, образуя один из склонов "ущелья" связи.

Точками на этом же рисунке обозначены места соединения с парным доменом оконечности той же ветви, образующим второй склон. Аминокислотный состав гипервариабильных участков на обоих склонах, очевидно, разный. Но "ущелье" на конце второй ветви молекулы антитела является точной копией "ущелья" на первой ветви.

Непосредственную область узнавания и связывания антигена в "ущелье" на конце ветви образуют около 20 аминокислот. Но еще не менее 70 аминокислот каждого из концевых доменов участвуют в определении пространственной конфигурации этой области.

Но вернемся к нашей программе создания аффинно-иммунной колонки. Понятна возможность реализации четырех ее первых пунктов. Из сыворотки иммунизированного кролика, двухмолярным раствором сульфата аммония осаждают суммарную фракцию глобулинов.

Затем ее растворяют, диализом освобождают от соли и наносят в буфере рН6,5 на колонку ДЕАЕ-целлюлозы. При таком значении рН IgG не задерживается на колонке и выходит сразу очищенным, поскольку все прочие глобулины остаются на колонке.

Одновременно подготавливают колонку на основе BrCN-активированной сефарозы и фиксируют на ней белок, которым был иммунизирован кролик. Раствор суммарной фракции IgG пропускают через эту колонку и промывают ее буфером. В результате на колонке задерживаются только антитела, специфичные для этого белка-антигена. Их можно снять 0,1М раствором уксусной кислоты или 4,5М раствором MgClg. Полученный таким образом раствор нужных антител нейтрализуют, диализуют от солей и, если надо, концентрируют упариванием воды.

Теперь встает последний вопрос. Как связать эти антитела с матрицей еще одной колонки, причем так, чтобы не пострадала их антигенная активность и специфичность? Нелегкий вопрос!

Но тут природа сделала исследователям роскошный подарок. Оказалось, что некий белок из оболочки бактерии Staphylococcus aureus, названный "белком А", способен прочно связываться с неизменной частью ("стержнем") большинства IgG.

За словом "оказалось" скрывается многое. Вряд ли белок с таким свойством специально искали именно у этой бактерии. Скорее всего его обнаружили случайно. (Но, как говорит пословица, ученый тот, кто видит то же, что видят все, но замечает то, что не заметил никто!).

Так или иначе, но обнаружение указанного свойства белка А открыло путь к осуществлению последнего этапа нашей программы. На колонку активированной сефарозы химически прочно сажают белок А (даже есть в продаже готовая "Protein А - Sepharose CL-4В") и через нее в определенных условиях пропускают раствор специфических антител. Они закрепляются на колонке через свои "стержни" и белок А.

Страницы: 1 2 3


Другое по теме:

Материалы исследования
Опыты проводили на новорожденных, а также в возрасте 14, 28, 45, 120 суток после рождения, самках и самцах белых беспородных крыс. Животных содержали в стандартных условиях вивариума. Животных декапитировали, извлекали головной мозг, гип ...

Синаптическая передача
Синаптическая передача – основные положения. Биосинтез нейромедиаторов, запасание в везикулах и выброс в синаптическую щель (экзоцитоз). Роль ионов Са2+ в синаптической трансмиссии. Механизмы инактивации высвободившихся нейротрансмиттеров ...

Волновая и электромагнитная теории света, понятие об эфире
Максвелл считал, что одной из частных разновидностей электромагнитных волн являются световые волны. Скорость света была измерена достаточно точно французом Физо в 1848 г. Она оказалась очень большой – около 300 000 км/сек, но конечной. Сл ...