За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 21мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и температуре 37оС в течении 1часа.
Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата оливкового масла.
Необходимые реактивы. Раствор оливкового масла (субстрат); 2%-ный раствор поливинилового спирта; 1н раствор соляной кислоты (HCl); 0,05н раствор гидроксида натрия (NaOH); фосфатно-цитратный буфер с рН 7,0; 1%-ный раствор фенолфталеина; 90%-ный раствор спирта; 1%-ный раствор фермента.
Техника определения. 5см3 эмульсии субстрата и 4см3 буфера с рН 7,0 помещают в колбу Эрленмейера на 100см3, которую закрывают пробкой. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 37оС в течении 10 минут. Затем к смеси добавляют 1см3 раствора фермента и хорошо перемешивают. Полученную смесь выдерживают при температуре 37оС в течении 1 часа, после чего немедленно добавляют 30см3 этанола для прекращения реакции. Раствор титруют 0,05н раствором NaOH в присутствии 1%-ного раствора фенолфталеина до исчезновения окраски.
Контрольную пробу готовя следующим образом. К смеси субстрата и буфера с рН 7,0, выдержанной при температуре 37оС, добавляют 30см3 этанола, затем 1см3 ферментного раствора и смесь немедленно титруют.
Разность между результатами титрований контрольной и опытной проб соответствует количеству 0,05н раствора NaOH, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента.
Липазную активность фермента ЛС (в ед/г) определяют по формуле (4):
ЛС=, (4)
где ЛС – липолитическая активность, ед/г;
А – разность между результатами титрований опытной и контрольной проб, см3;
Т – титр щелочи;
В – концентрация образца ферментного раствора, г/см3.
Другое по теме:
Теория радиоактивности Резерфорда-Содди
В 1898 г. супруги Кюри открывают радий, а Резерфорду удаётся расщепить радиоактивные лучи Беккереля.
Самое удивительное в явлении радиоактивности - постоянное выделение энергии. Самое непонятное - откуда она возникает?
Радий – исключитель ...
Доказательства происхождения человека от животных.
1. Научное обоснование Ч. Дарвинем идеи происхождения человека от животных на основе установления сходства человека с млекопитающими животными, особенно с человекообразными обезьянами. Утверждение Ч. Дарвина, что современные человекообра ...
Гипоэритропоэтические анемии вследствие нарушения регуляции деления и
созревания эритрокариоцитов. Гемолитические анемии
Гемолитические анемии – связаны с уменьшением средней продолжительности жизни и/или повышенным разрушением эритроцитов. Различают:
1) наследственные гемолитические анемии. К ним относятся:
=вследствие мембранного дефекта. Это – наследст ...