Определение активности липазы (ЛС) (модифицированный метод Ота, Ямада)

Биология » Микроорганизмы, выделенные из различных природных жиров » Определение активности липазы (ЛС) (модифицированный метод Ота, Ямада)

За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 21мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и температуре 37оС в течении 1часа.

Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата оливкового масла.

Необходимые реактивы. Раствор оливкового масла (субстрат); 2%-ный раствор поливинилового спирта; 1н раствор соляной кислоты (HCl); 0,05н раствор гидроксида натрия (NaOH); фосфатно-цитратный буфер с рН 7,0; 1%-ный раствор фенолфталеина; 90%-ный раствор спирта; 1%-ный раствор фермента.

Техника определения. 5см3 эмульсии субстрата и 4см3 буфера с рН 7,0 помещают в колбу Эрленмейера на 100см3, которую закрывают пробкой. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 37оС в течении 10 минут. Затем к смеси добавляют 1см3 раствора фермента и хорошо перемешивают. Полученную смесь выдерживают при температуре 37оС в течении 1 часа, после чего немедленно добавляют 30см3 этанола для прекращения реакции. Раствор титруют 0,05н раствором NaOH в присутствии 1%-ного раствора фенолфталеина до исчезновения окраски.

Контрольную пробу готовя следующим образом. К смеси субстрата и буфера с рН 7,0, выдержанной при температуре 37оС, добавляют 30см3 этанола, затем 1см3 ферментного раствора и смесь немедленно титруют.

Разность между результатами титрований контрольной и опытной проб соответствует количеству 0,05н раствора NaOH, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента.

Липазную активность фермента ЛС (в ед/г) определяют по формуле (4):

ЛС=, (4)

где ЛС – липолитическая активность, ед/г;

А – разность между результатами титрований опытной и контрольной проб, см3;

Т – титр щелочи;

В – концентрация образца ферментного раствора, г/см3.


Другое по теме:

Физическая работа как стресс – воздействие
Защитная функция первой стадии стресса (реакции тревоги) преимущественно связана с эффектом воздействия АДР и НА. Увеличение АДР и НА в крови и тканях организма являются первыми химическими звеньями в развитии стресса. Нередко их называют ...

Время и генетическая дивергенция
Скорости и способы видообразования очень удобно рассмотреть на примере большой группы видов сем. Drosophilidae, эндемичных для Гавайских островов, которую так отлично изучил Карсон (Н. Carson) со своими сотрудниками и студентами. Наш выбо ...

Белый гусь (Сhen hyperboreus)
Гусь снежно-белой с черными вершинами крыльев, образованными чёрными первостепенными маховыми перьями. Клюв и лапы красноватые. Длина тела 580-730 мм, вес 2,0- 2,2 кг. Распространен преимущественно в Северной Америке от мыса. Барроу на ...