За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 21мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и температуре 37оС в течении 1часа.

Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата оливкового масла.

Необходимые реактивы. Раствор оливкового масла (субстрат); 2%-ный раствор поливинилового спирта; 1н раствор соляной кислоты (HCl); 0,05н раствор гидроксида натрия (NaOH); фосфатно-цитратный буфер с рН 7,0; 1%-ный раствор фенолфталеина; 90%-ный раствор спирта; 1%-ный раствор фермента.

Техника определения. 5см3 эмульсии субстрата и 4см3 буфера с рН 7,0 помещают в колбу Эрленмейера на 100см3, которую закрывают пробкой. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 37оС в течении 10 минут. Затем к смеси добавляют 1см3 раствора фермента и хорошо перемешивают. Полученную смесь выдерживают при температуре 37оС в течении 1 часа, после чего немедленно добавляют 30см3 этанола для прекращения реакции. Раствор титруют 0,05н раствором NaOH в присутствии 1%-ного раствора фенолфталеина до исчезновения окраски.

Контрольную пробу готовя следующим образом. К смеси субстрата и буфера с рН 7,0, выдержанной при температуре 37оС, добавляют 30см3 этанола, затем 1см3 ферментного раствора и смесь немедленно титруют.

Разность между результатами титрований контрольной и опытной проб соответствует количеству 0,05н раствора NaOH, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента.

Липазную активность фермента ЛС (в ед/г) определяют по формуле (4):

ЛС=, (4)

где ЛС – липолитическая активность, ед/г;

А – разность между результатами титрований опытной и контрольной проб, см3;

Т – титр щелочи;

В – концентрация образца ферментного раствора, г/см3.

Другое по теме:

Христианство
Христианство, как религиозная система, оказавшая решающее воздействие на средневековую мысль, не сразу превратилось в господствующую идеологию. Потребовалось много времени, чтобы из учения немногих иудейских сект оно стало мировой религие ...

Анализ содержание GSH и активность глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей, проживающих в различных по уровню загрязнения районах г.Красноярска
Город Красноярск административно разделен на 7 районов, различаемых по уровню техногенной нагрузки, которая определяется структурой промышленности и энергетики, исходного и получаемого продукта, особенностями природно-климатических услови ...

Жизнь. От атомов к протожизни. Неорганические и органические соединения и их многообразие
Молекулы находятся в непрерывном движении и сталкиваются друг с другом. Обычно при этом они просто отскакивают в разные стороны, так как их электронные оболочки отталкиваются. Но сильное соударение может вызвать перегруппировку электронов ...