За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 21мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и температуре 37оС в течении 1часа.

Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата оливкового масла.

Необходимые реактивы. Раствор оливкового масла (субстрат); 2%-ный раствор поливинилового спирта; 1н раствор соляной кислоты (HCl); 0,05н раствор гидроксида натрия (NaOH); фосфатно-цитратный буфер с рН 7,0; 1%-ный раствор фенолфталеина; 90%-ный раствор спирта; 1%-ный раствор фермента.

Техника определения. 5см3 эмульсии субстрата и 4см3 буфера с рН 7,0 помещают в колбу Эрленмейера на 100см3, которую закрывают пробкой. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 37оС в течении 10 минут. Затем к смеси добавляют 1см3 раствора фермента и хорошо перемешивают. Полученную смесь выдерживают при температуре 37оС в течении 1 часа, после чего немедленно добавляют 30см3 этанола для прекращения реакции. Раствор титруют 0,05н раствором NaOH в присутствии 1%-ного раствора фенолфталеина до исчезновения окраски.

Контрольную пробу готовя следующим образом. К смеси субстрата и буфера с рН 7,0, выдержанной при температуре 37оС, добавляют 30см3 этанола, затем 1см3 ферментного раствора и смесь немедленно титруют.

Разность между результатами титрований контрольной и опытной проб соответствует количеству 0,05н раствора NaOH, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента.

Липазную активность фермента ЛС (в ед/г) определяют по формуле (4):

ЛС=, (4)

где ЛС – липолитическая активность, ед/г;

А – разность между результатами титрований опытной и контрольной проб, см3;

Т – титр щелочи;

В – концентрация образца ферментного раствора, г/см3.

Другое по теме:

Гуменник Anser fa balls (Latham, 1987)
В Амурской области на пролете встречаются два подвида гуменников: тундровый (Anser fabalis serri-rostris) и таежный (Anser fabalis middendorffii). Последний очень редок. У основания надклювья узкая белая полоска, у некоторых форм заменяю ...

Эмоциональный орган чувств
"Я живу как отверженный", - писал 32-летний Людвиг Ван Бетховен под давлением быстро прогрессирующей глухоты в своем "Хейлигенштадтском Завещании". - "О, вы, люди, которые считаете, меня враждебно настроенным или ...

Строение и структура систем
Для лучшего понимания природы систем необходимо рассмотреть сначала их строение и структуру, а затем их классификацию. Строение системы характеризуется теми компонентами, из которых она образована. Такими компонентами – являются: подсист ...