Метод определения протеолитической активности (ПС) Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в модификации

Биология » Микроорганизмы, выделенные из различных природных жиров » Метод определения протеолитической активности (ПС) Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в модификации

Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Активность (ПС) выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 1г препарата или 1см3 ферментного раствора за 1 час при температуре 40оС.

За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1мг аминного азота за 1 час в принятых условиях опыта.

Необходимые реактивы. Фосфатный буферный раствор с рН 7,3-7,5; 5%-ный раствор желатина, приготовленный на основе буферного раствора, перед употреблением раствор желатина нагревают на водяной бане до 40оС; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина; 0,1н раствор гидроксида натрия; 96%-ный этиловый спирт.

Техника определения. К 10см3 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 приливают 2см3 испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1см3 реакционной смеси в коническую колбу на 50-100см3, куда предварительно налито 20см3 96%-ного этилового спирта и 0,2см3 1%-ного раствора тимолфталеина. Пробу тут же титруют 0,1н раствором гидроксида натрия. После появления голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титрование проводят из микробюретки с ценой деления 0,02см3.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40оС для гидролиза. Через 3 часа 1см3 реакционной смеси отбирают во вторую коническую колбочку на 50-100см3, куда предварительно налито 20см3 96%-ного этилового спирта и 0,2см3 1%-ного раствора тимолфталеина и титруют аналогично контролю.

Расчет протеолитической активности ПС ведут по формуле (2):

ПС = , (2)

где ПС – протеолитичсекая активность, ед/г;

А – количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;

t – время протеолиза, ч;

Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1г препарата или 1см3 жидкого ферментного раствора.

Величина А рассчитывается по формуле (3):

А=(а-ак)×1,4×К, (3)

где A – количество аминного азота, мг;

а – количество 0,1н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1см3 опытной пробы, см3;

ак – то же, для контрольной пробы;

1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К – поправка к титру щелочи.


Другое по теме:

Срочная адаптация
Основой срочной адаптации является структурно-функциональная перестройка, происходящая в организме непосредственно при выполнении физической работы. Целью этого этапа адаптации является создание мышцам оптимальных условий для их функциони ...

Определение активности липазы (модифицированный метод Ота, Ямада)
За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 1 мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и t=37°С в течение 1 ч. Метод основан на определении путем ти ...

Ближний и дальний порядки в природе
Ближний порядок - относительно упорядоченное расположение соседних частиц внутри малых объемов вещества. Дальний порядок - регулярное периодическое расположение частиц вещества по всему занимаемому им объему. Строгое определение порядка ...