Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.
Активность (ПС) выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 1г препарата или 1см3 ферментного раствора за 1 час при температуре 40оС.
За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1мг аминного азота за 1 час в принятых условиях опыта.
Необходимые реактивы. Фосфатный буферный раствор с рН 7,3-7,5; 5%-ный раствор желатина, приготовленный на основе буферного раствора, перед употреблением раствор желатина нагревают на водяной бане до 40оС; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина; 0,1н раствор гидроксида натрия; 96%-ный этиловый спирт.
Техника определения. К 10см3 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 приливают 2см3 испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1см3 реакционной смеси в коническую колбу на 50-100см3, куда предварительно налито 20см3 96%-ного этилового спирта и 0,2см3 1%-ного раствора тимолфталеина. Пробу тут же титруют 0,1н раствором гидроксида натрия. После появления голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титрование проводят из микробюретки с ценой деления 0,02см3.
Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40оС для гидролиза. Через 3 часа 1см3 реакционной смеси отбирают во вторую коническую колбочку на 50-100см3, куда предварительно налито 20см3 96%-ного этилового спирта и 0,2см3 1%-ного раствора тимолфталеина и титруют аналогично контролю.
Расчет протеолитической активности ПС ведут по формуле (2):
ПС = , (2)
где ПС – протеолитичсекая активность, ед/г;
А – количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;
t – время протеолиза, ч;
Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1г препарата или 1см3 жидкого ферментного раствора.
Величина А рассчитывается по формуле (3):
А=(а-ак)×1,4×К, (3)
где A – количество аминного азота, мг;
а – количество 0,1н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1см3 опытной пробы, см3;
ак – то же, для контрольной пробы;
1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;
К – поправка к титру щелочи.
Другое по теме:
Размножение черенками
Наиболее распространено размножение стеблевыми черенками. Черенком называется любая отделенная от стебля часть, которая в благоприятных условиях развивается в самостоятельное растение. Лучшее время для черенкования — весна (март — апрель) ...
Витамины
В 1880 г. русский ученый Н. И. Лунин обнаружил, что мыши погибают, если их кормить искусственной пищевой смесью из очищенных продуктов. Если к рациону добавлять 1 мл молока, то они остаются здоровыми. Таким образом установили, что для пол ...
Эволюция и эпигенез
Противопоставление эволюции (как развития, развертывания) эпигенезу было распространено в биологии в прежнее время; в настоящее время предпочитают употреблять в этом противоположении термин "преформация" вместо "эволюция&qu ...