Метод определения протеолитической активности (ПС) Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в модификации

Биология » Микроорганизмы, выделенные из различных природных жиров » Метод определения протеолитической активности (ПС) Вильштеттера и Вальдшмидт-Лейтца в модификации

Метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Активность (ПС) выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 1г препарата или 1см3 ферментного раствора за 1 час при температуре 40оС.

За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1мг аминного азота за 1 час в принятых условиях опыта.

Необходимые реактивы. Фосфатный буферный раствор с рН 7,3-7,5; 5%-ный раствор желатина, приготовленный на основе буферного раствора, перед употреблением раствор желатина нагревают на водяной бане до 40оС; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина; 0,1н раствор гидроксида натрия; 96%-ный этиловый спирт.

Техника определения. К 10см3 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 приливают 2см3 испытуемого ферментного раствора и сразу же отбирают 1см3 реакционной смеси в коническую колбу на 50-100см3, куда предварительно налито 20см3 96%-ного этилового спирта и 0,2см3 1%-ного раствора тимолфталеина. Пробу тут же титруют 0,1н раствором гидроксида натрия. После появления голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титрование проводят из микробюретки с ценой деления 0,02см3.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40оС для гидролиза. Через 3 часа 1см3 реакционной смеси отбирают во вторую коническую колбочку на 50-100см3, куда предварительно налито 20см3 96%-ного этилового спирта и 0,2см3 1%-ного раствора тимолфталеина и титруют аналогично контролю.

Расчет протеолитической активности ПС ведут по формуле (2):

ПС = , (2)

где ПС – протеолитичсекая активность, ед/г;

А – количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;

t – время протеолиза, ч;

Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1г препарата или 1см3 жидкого ферментного раствора.

Величина А рассчитывается по формуле (3):

А=(а-ак)×1,4×К, (3)

где A – количество аминного азота, мг;

а – количество 0,1н раствора NaOH, пошедшее на титрование 1см3 опытной пробы, см3;

ак – то же, для контрольной пробы;

1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К – поправка к титру щелочи.


Другое по теме:

Материал и методика исследования
Объектами исследования являются многолетние травянистые растения[3]: Прозанник пятнистый – Achyrophorus maculatus L. (семейство Сложноцветные; 2n = 10, рис. 1А; стр. I) и два вида подорожника: Подорожник ланцетолистный – Plantago lanceola ...

Импульс, энергия и момент системы как меры движения
Для материальной точки произведение массы тела (или частицы) на его скорость называют его импульсом p=mv. Энергия представляет собой способность совершать работу. Существует три основных вида энергии: 1) кинетическая энергия, характериз ...

Методы изучения клетки: микроспектромериз, цитофотометрия, флуоресцентная и ультрафиолетовая микроскопия. Метод чисторадиографии
Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние влияют на контрастность изображения. Микроспектромериз Метод светлого поля и его разновидности Ме ...