Метод определения активности ферментов

Активность ферментов определяли флюорометрическим методом по Fricker L. D., Snyder S. H. [330].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (контрольная проба) натрий-ацетатного буфера или к смеси 140 мкл буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (опытная пробя). При определении активности ФМСФ-КП использовали ту же схему, с той лишь разницей, что в качестве ингибитора использовали 25 мМ спиртовой раствор ФМСФ, который добавляли после смешивания гомогената ткани с буфером.

Пробы преинкубировались 8 мин при 37оС.

Реакцию начинали прибавлением 50 мкл 210 мкМ субстрата – дансил-Phe-Ala-Arg для определения активности КПН или дансил-Phe-Leu-Arg для определения активности ФМСФ-КП (конечная концентрация субстратов в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1 М раствора соляной кислоты. Для экстракции продукта реакции – дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu – к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 с. Для разделения фаз пробы центрифугировали 5 мин при 1000 g. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при lex=360 нм и lem=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-Phe-Ala в хлороформе.

Активность ферментов определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, не содержащих и содержащих ингибитор, и выражали в нмоль дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu, образовавшихся за 1 мин инкубации, в пересчете на 1 мг белка.

Содержание белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [244].


Другое по теме:

Физические процессы передачи информационного сигнала в живом организме
Рассмотрим немного подробнее нервную систему человека в связи с проблемой памяти. Главная функция нервной системы состоит в переработке и передаче информации от рецепторов органов чувств через центральную нервную систему к органам-исполни ...

Древнейшие и древние люди
Древнейшие люди жили 2 млн. – 500 тыс. лет назад. Питекантроп – «обезьяночеловек». Останки были обнаруженысначала на о. Ява в 1891 году Е. Дюбуа, а затем в ряде других мест.Питекантропы ходили на двух ногах, объем мозга у них увеличился, о ...

Особенности неклассического естествознания
В конце 19 - начале 20 века на арену выходят новые общественные отношения и экономические теории, колоссально развивается техника. В этот время, называемый третьей научной революцией, начинается новый неклассический период в естествознани ...