Метод определения активности ферментов

Активность ферментов определяли флюорометрическим методом по Fricker L. D., Snyder S. H. [330].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (контрольная проба) натрий-ацетатного буфера или к смеси 140 мкл буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (опытная пробя). При определении активности ФМСФ-КП использовали ту же схему, с той лишь разницей, что в качестве ингибитора использовали 25 мМ спиртовой раствор ФМСФ, который добавляли после смешивания гомогената ткани с буфером.

Пробы преинкубировались 8 мин при 37оС.

Реакцию начинали прибавлением 50 мкл 210 мкМ субстрата – дансил-Phe-Ala-Arg для определения активности КПН или дансил-Phe-Leu-Arg для определения активности ФМСФ-КП (конечная концентрация субстратов в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1 М раствора соляной кислоты. Для экстракции продукта реакции – дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu – к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 с. Для разделения фаз пробы центрифугировали 5 мин при 1000 g. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при lex=360 нм и lem=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-Phe-Ala в хлороформе.

Активность ферментов определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, не содержащих и содержащих ингибитор, и выражали в нмоль дансил-Phe-Ala или дансил-Phe-Leu, образовавшихся за 1 мин инкубации, в пересчете на 1 мг белка.

Содержание белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [244].


Другое по теме:

Спонтанный мутагенез
Хроническое облучение вызывает достоверное увеличение частоты аберрантных анафаз в опытных популяциях A. maculatus (p << 0,001) и P. media (p < 0,01), в то же время, в популяциях P. lanceolata отмеченного феномена не наблюдается ...

Физиологическое значение текучести мембран
Обычно биомембраны находятся в жидкокристаллическом состоянии, и, по-видимому, поддержание такого состояния очень важно для их функционирования. При переходе мембраны из жидкокристаллической фазы в фазу геля текучесть уменьшается примерно ...

Естественный отбор — движущая сила эволюции органического мира
Сущность естественного отбора. Какие организмы выживают лучше в борьбе за существование? Потомство любой пары диких организмов неоднородно по своим наследственным особенностям. Индивидуальные уклонения в определенных условиях среды могу ...