Вычислили содержание пигментов в вытяжке, тут же посчитали их содержание с учетом объема, массы пробы и разведения.
Fа = 9*20/1000*1 = 0,18г/г
Fв = 67,4*20/1000*1 = 1,35 мг/г
Fкар = -17*20/1000*1 = -0,34 мг/г
Нанесение пигментов на бумагу
Для разделения пигментов используют лист бумаги размером 16х16 см.
При одномерной хроматографии 1 мл полученной вытяжки наносят полосой длиной 12 см на расстоянии 2 см от нижнего края листа. Нанесли 1,4 мл образца.
Разделение пигментов на одномерной хроматограмме
На одномерной хроматограмме в зависимости от применяемой для разгонки смеси растворителей удается отделить каротин, ксантофиллы и хлорофилл а и в.
Хроматограмму помещают в камеру, заполненную 30 мл смеси, состоящей из бензола и петролейного эфира (2:1). Через 30-40 минут, когда фронт растворителя поднимется на 14 см и будет видно четкое разделение пигментов, хроматограмму вынимают и подсушивают. Самую верхнюю полосу образует каротин, ниже него лежит хлорофилл а, под ним распологаются ксантофиллы, а самый последний – хлорофилл в.
Окрашенные полосы, соответствующие пигментам вырезают, измельчают и переносят в отдельные бюксы на 25 мл. Каротин эллюируется хлороформом, ксантофиллы и хлорофиллы – смесью спирта с ацетоном (1:3).
Растворитель добавляют небольшими порциями, каждый раз настаивая 2-3 минуты.
Эллюция пигментов с бумажного носителя
Эллюцию проводят до полного обесцвечивания бумаги. Элюат фильтруется через стеклянный фильтр или центрифугируется для удаления взвешенных частиц бумаги. Экстракт аккуратно сливают в мерные пробирки и доводят до 5-10 мл в зависимости от интенсивности окрашивания. Полученные экстракты используют для фотоколориметрии с использованием калибровочной кривой, построенной для определенного прибора.
Для получения калибровочных кривых использовали два раствора – раствор Гетри (для зеленых пигментов) и двухромовокислый калий (для желтых пигментов).
Определение оптической плотности пигментов
Оптическую плотность элюата определяют на фотоэлектроколориметре, за синим светофильтром для желтых пигментов и красным для зеленых. Желательно работать в средней области шкалы, где относительная ошибка прибора минимальна.
Оптическая плотность элюата
Д |
Хлорофилл а |
Хлорофилл в |
каротин |
0,015 |
0,01 |
0,025 |
Перед тем, как рассчитать содержание пигментов, была построена калибровочная кривая. Использовали раствор известной концентрации 1% CuSO4*5H2O – 25,5 мл; 2%К2Сr2O7 – 50 мл; 7% - NН4ОН (100мл раствора).
Желтые пигменты
разведение |
Д |
1:0 |
0,745 |
1:1 |
0,35 |
1:2 |
0,274 |
1:3 |
0,235 |
1:4 |
0,19 |
1:5 |
0,165 |
1:6 |
0,133 |
Другое по теме:
Энергетический метаболизм мозга
Высокий уровень энергетического обмена – специфическая особенность мозга. Глюкоза, как основной энергетический субстрат для мозга. Потребление кислорода и глюкозы разными структурами мозга. Альтернативные энергетические субстраты, которые ...
Нейтральная эндопептидаза
Эндопептидаза . (NEP, нейтральная эндопептидаза, энкефалиназа, энкефалиназа A, неприлизин, CALLA) – интегральный трансмемранный белок плазматических мембран, катализирующий расщепление пептидных связей внутри низкомолекулярных пептидов с ...
Методы клонирования животных
Последние десятилетия XX века ознаменовались бурным развитием одной из главных ветвей биологической науки -- молекулярной генетики. Уже в начале 70-х годов ученые в лабораторных условиях начали получать и клонировать рекомбинантные молеку ...