SLIC (sequence and ligation-independent cloning) метод клонирования

Клонирование животных » SLIC (sequence and ligation-independent cloning) метод клонирования

Стив Элледж и неутомимая Мами Ли в очередной раз порадовали научное сообщество оригинальным методом клонирования. Новый метод получил название SLIC (sequence and ligation-independent cloning). Новинка является модификацией известного метода LIC (ligation-independent cloning) - клонирования без использования лигазы. Для того чтобы вставить фрагмент ДНК в вектор при помощи классического метода LIC, достаточно смешать вектор и вставку, на концах которых расположены протяженные одноцепочечные участки, комплементарные друг другу. При этом вставка "прилипает" к вектору, образуя рекомбинантную плазмиду с никами в обеих цепях. Полученной плазмидой трансформируют Е.coli, система репарации которой восстанавливает нормальную структуру плазмиды.

Метод SLIC - это то же самое, что и LIC с единственной разницей: "слипание" вектора и вставки проводят в присутствии белка RecA. Эта незначительная модификация метода позволяет добиться достаточно высокого выхода (1 нг. вектора способен дать 3900 трансформантов) а также упростить саму процедуру клонирования. Так если для классического метода LIC необходимо точно подогнать размер одноцепочечных участков у вектора и вставки (чтобы в итоге на стыке вектора и вставки получились ники), то метод SLIC допускает наличие протяженных гэпов [19].

Фактор RecA- один из ключевых факторов репарации и рекомбинации E.coli. Связываясь с одноцепочечным участком ДНК, RecA стимулирует процесс "strand exchange" (в ходе этого процесса одноцепочечный участок одной молекулы ДНК встраивается в гомологичный двухчепоченый участок другой молекулы ДНК, образуя D-петлю). Очевидно, добавление RecA in vitro на шаге клонирования позволяет E.coli эффективнее репарировать плазмиду in vivo.

Для успешного клонирования необходимо наличие 30-ти нуклеотидных участков гомологии по краям вектора и вставки. Получать одноцепочечные участки предлагается с помощью T4 ДНК-полимеразы без добавления нуклеотидов. При помощи SLIC в один вектор можно запихнуть сразу 5 вставок в одну стадию без снижения выхода. Наконец, высокий выход позволяет использовать метод SLIC при клонировании библиотек [7].


Другое по теме:

Естественнонаучная картина мира в исторической динамике культуры. Научные картины мира и научные революции в истории естествознания
Объектами естествознания являются: природа в целом, а так же биологические (естественные) начала человека и общества. Данные объекты исследуются различными специализированными областями естествознания (биология, физика, химия, космология ...

Расы и их происхождение.
Наука о расах называется Расоведение. Расоведение изучает расовыеособенности (морфологические), происхождение, формирование, историю. ...

Конкуренция мотиваций
Исходя из простой теории конкуренции мотиваций, можно было бы ожидать, что находящееся в состоянии голода и жажды животное будет вести себя, таким образом, т.е. пить оно станет тогда, когда жажда у него будет сильнее голода, а есть - когд ...