SLIC (sequence and ligation-independent cloning) метод клонирования

Клонирование животных » SLIC (sequence and ligation-independent cloning) метод клонирования

Стив Элледж и неутомимая Мами Ли в очередной раз порадовали научное сообщество оригинальным методом клонирования. Новый метод получил название SLIC (sequence and ligation-independent cloning). Новинка является модификацией известного метода LIC (ligation-independent cloning) - клонирования без использования лигазы. Для того чтобы вставить фрагмент ДНК в вектор при помощи классического метода LIC, достаточно смешать вектор и вставку, на концах которых расположены протяженные одноцепочечные участки, комплементарные друг другу. При этом вставка "прилипает" к вектору, образуя рекомбинантную плазмиду с никами в обеих цепях. Полученной плазмидой трансформируют Е.coli, система репарации которой восстанавливает нормальную структуру плазмиды.

Метод SLIC - это то же самое, что и LIC с единственной разницей: "слипание" вектора и вставки проводят в присутствии белка RecA. Эта незначительная модификация метода позволяет добиться достаточно высокого выхода (1 нг. вектора способен дать 3900 трансформантов) а также упростить саму процедуру клонирования. Так если для классического метода LIC необходимо точно подогнать размер одноцепочечных участков у вектора и вставки (чтобы в итоге на стыке вектора и вставки получились ники), то метод SLIC допускает наличие протяженных гэпов [19].

Фактор RecA- один из ключевых факторов репарации и рекомбинации E.coli. Связываясь с одноцепочечным участком ДНК, RecA стимулирует процесс "strand exchange" (в ходе этого процесса одноцепочечный участок одной молекулы ДНК встраивается в гомологичный двухчепоченый участок другой молекулы ДНК, образуя D-петлю). Очевидно, добавление RecA in vitro на шаге клонирования позволяет E.coli эффективнее репарировать плазмиду in vivo.

Для успешного клонирования необходимо наличие 30-ти нуклеотидных участков гомологии по краям вектора и вставки. Получать одноцепочечные участки предлагается с помощью T4 ДНК-полимеразы без добавления нуклеотидов. При помощи SLIC в один вектор можно запихнуть сразу 5 вставок в одну стадию без снижения выхода. Наконец, высокий выход позволяет использовать метод SLIC при клонировании библиотек [7].


Другое по теме:

Естественный отбор — движущая сила эволюции органического мира
Сущность естественного отбора. Какие организмы выживают лучше в борьбе за существование? Потомство любой пары диких организмов неоднородно по своим наследственным особенностям. Индивидуальные уклонения в определенных условиях среды могу ...

Заключение. Уменьшение риска, связанного с генными технологиями
Совершенно ясно, что главное при разработке правил и законов, регулирующих применение генных технологий,— это создать рациональные концепции оценки риска. Действительно, как оценить риск того, чего еще никогда не случалось? Первый шаг в ...

Ядовитые морские животные
Существует много ядовитых рыб. У рыб ядовитые внутренние органы, кровь, печень, они несъедобны. И наносят врагам болезненные и плохо заживающие раны ядовитыми выростами, колючками и шипами. Ядовитые свойства некоторых рыб и моллюсков про ...