SLIC (sequence and ligation-independent cloning) метод клонирования

Клонирование животных » SLIC (sequence and ligation-independent cloning) метод клонирования

Стив Элледж и неутомимая Мами Ли в очередной раз порадовали научное сообщество оригинальным методом клонирования. Новый метод получил название SLIC (sequence and ligation-independent cloning). Новинка является модификацией известного метода LIC (ligation-independent cloning) - клонирования без использования лигазы. Для того чтобы вставить фрагмент ДНК в вектор при помощи классического метода LIC, достаточно смешать вектор и вставку, на концах которых расположены протяженные одноцепочечные участки, комплементарные друг другу. При этом вставка "прилипает" к вектору, образуя рекомбинантную плазмиду с никами в обеих цепях. Полученной плазмидой трансформируют Е.coli, система репарации которой восстанавливает нормальную структуру плазмиды.

Метод SLIC - это то же самое, что и LIC с единственной разницей: "слипание" вектора и вставки проводят в присутствии белка RecA. Эта незначительная модификация метода позволяет добиться достаточно высокого выхода (1 нг. вектора способен дать 3900 трансформантов) а также упростить саму процедуру клонирования. Так если для классического метода LIC необходимо точно подогнать размер одноцепочечных участков у вектора и вставки (чтобы в итоге на стыке вектора и вставки получились ники), то метод SLIC допускает наличие протяженных гэпов [19].

Фактор RecA- один из ключевых факторов репарации и рекомбинации E.coli. Связываясь с одноцепочечным участком ДНК, RecA стимулирует процесс "strand exchange" (в ходе этого процесса одноцепочечный участок одной молекулы ДНК встраивается в гомологичный двухчепоченый участок другой молекулы ДНК, образуя D-петлю). Очевидно, добавление RecA in vitro на шаге клонирования позволяет E.coli эффективнее репарировать плазмиду in vivo.

Для успешного клонирования необходимо наличие 30-ти нуклеотидных участков гомологии по краям вектора и вставки. Получать одноцепочечные участки предлагается с помощью T4 ДНК-полимеразы без добавления нуклеотидов. При помощи SLIC в один вектор можно запихнуть сразу 5 вставок в одну стадию без снижения выхода. Наконец, высокий выход позволяет использовать метод SLIC при клонировании библиотек [7].


Другое по теме:

Молочнокислые бактерии
Молочнокислые бактерии широко распространены в природе. В определенных условиях они могут вызвать порчу многих пищевых продуктов. По морфологическим признакам их делят на стрептококки и палочки. В каждой группе имеются гомо- и- гетерофер ...

Постцентральная извилина
Постцентральная извилина (лат. gyrus postcentralis) — участок теменной доли коры больших полушарий головного мозга. В постцентральной извилине заканчиваются пути поверхностной и глубокой чувствительности. Постцентральная извилина распола ...

Эволюция ферментных систем и отбор
Организация протобионтов должна была послужить исходной точкой для их дальнейшей эволюции на пути становления жизни. Главным в этой организации являлось то, что протобионты были не только динамически устойчивыми системами, не только могли ...