Выделение микробных липаз из микроорганизмов
Страница 2

При биосинтезе ферментов микроорганизмами большое значение имеют условия развития культуры и в первую очередь состав питательной среды. В связи с этим представляло интерес изучить влияние солей среды не биосинтез липазы культурой Candida paralipolytica 739. Путем поочередного исключения солей установили, что все минеральные соли, входящие в состав питательной среды необходимы для биосинтеза фермента. Выявили, что на образование липазы положительно влияют соли аммония и мочевина, нитраты заметно снижают активность липазы. Также проверяли зависимость липазной активности в культуральной жидкости от возраста посевного материала. Полученные данные позволяют сделать следующие выводы:

1) при биосинтезе липазы дрожжами Candida paralipolytica 739 максимальная липолитическая активность достигается в средах при использовании в качестве источника углерода глюкозы; дисахариды мальтоза, сахароза и лактоза несколько снижают активность фермента, а уксусная кислота полностью прекращает его синтез;

2) в углеводной среде соли аммония имеют преимущество по сравнению с нитратами как источником азота;

3) при биосинтезе немаловажную роль играет возраст посевного материала, максимальные показатели соответствуют двухсуточной культуре /49/.

Для определения липолитической активности использовали метод, основанный на титрометрическом определении свободных жирных кислот, образовавшихся при гидролизе липидов. В качестве субстрата использовали оливковое масло, эмульгированное поливиниловым спиртом (степень полимеризации 1725, вязкость 30 сП). Эмульсию готовили следующим образом: к 100 мл оливкового масла добавляли 150 мл 2%-ного водного раствора поливинилового спирта и эмульгировали в течение 20 мин при комнатной температуре (рН 8). Эмульсия была стабильна 24 ч. Реакционная смесь содержала 5 мл субстрата, 4 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН=7,8). Реакционную смесь выдерживали 10 мин при температуре 340, прибавляли 1 мл ферментного раствора. После 60-минутного инкубирования реакцию останавливали добавлением 20 мл этанола и ацетона (1:1). Образовавшуюся олеиновую кислоту оттитровывали 0,05 н. щелочью в присутствии тимолфталеина. За единицу липазной активности принимали такое количество фермента, которое отщепляет 1 мкмоль жирных кислот от эмульсии триолеата за 1 ч при 340.

Ферментативный препарат липазы получали по следующей схеме: 1) отделение биомассы от ферментативного раствора; 2) осаждение фермента органическим растворителями или высаливание; 3) освобождение фермента от солей и низкомолекулярных примесей с помощью хроматографии на колонке с сефадексом Г-25 или диализом; 4) лиофилизация или осаждение ацетоном.

Ферментативный раствор центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин для отделения биомассы. Согласно литературным данным, для получения сухого, частично очищенного препарата используют фракционное осаждение органическими растворителями (изопропанолом, этанолом, ацетоном). Оптимальный вариант для получения липазного препарата из ферментативного раствора Candida paralipolytica 739 – высаливание фермента сульфатом аммония /50/.

Фермент из ферментативного раствора осаждали фракционированием сульфатом аммония в интервале насыщения 0,4–0,7. Фермента с самой высокой липолитической активностью осаждался при степени насыщения сульфатом аммония 0,5. При более высокой степени насыщения вместе с ферментом выпадал и белок, не обладающий липолитической активностью. Концентрированный раствор фермента освобождали от солей и низкомолекулярных примесей на колонке с сефадексом Г-25 и диализом (вода) в течение 24 ч. После диализа или гель-фильтрации раствор фермента лиофилизировали или осаждали ацетоном. Препарат хорошо выдерживал лиофилизацию и не терял активности при хранении в лиофилизированном состоянии при температуре 40С в течение 6 месяцев.

Таким образом, можно сделать вывод, что исследованный препарат в дальнейшем может быть использован для получения высокоочищенной и кристаллической липазы, а также в некоторых отраслях народного хозяйства.

Страницы: 1 2 


Другое по теме:

Термоустойчивые молочнокислые палочки
Эти микроорганизмы могут выдерживать кратковременное нагревание в молоке при температуре 85-90 °С, иногда выше, что является важным отличительным признаком этих бактерий от других видов термофильных молочнокислых палочек. Клетки представ ...

Экономическая часть. Расчет экономической эффективности экобиотехнологического процесса обезжиривания меховой овчины
В настоящее время сложная экологическая обстановка и рыночные отношения предъявляют предприятиям легкой промышленности ряд новых требований: предприятия должны выпускать конкурентоспособную продукцию, удовлетворяющую требованиям потребите ...

Морфологические особенности эритроцитов
В норме эритроцит имеет форму двояковогнутого диска с утолщением по краям и просветлением в центре. В условиях патологии эритроциты могут изменяться: А. по размеру; Б. по окраске; В. по форме; Г. по включениям. А. Изменения эритроци ...