Выделение микробных липаз из микроорганизмов
Страница 1

Известны микроорганизмы, продуцирующие липазы, оптимум действия которых находится в области высоких температур: 50–550С Pseudomonas fragi, 700С Pseudomonas mephitica. В связи с этим представляется актуальным поиск активных продуцентов липаз, специфичных к твердым жирам, содержащимся в промышленных отходов, а также продуцентов липаз с более высокими температурными оптимума действия. Такие исследования имеют большое значение в связи с экологическими проблемами, связанными с очисткой сточных вод в масло-жировой промышленности /45/.

Первоначально скрининг продуцентов липаз проведен качественным методом Эйкмана, при котором в стерильные чашки Петри разливают тонким слоем простерилизованный животный жир и после его застывания вводят агаризованную питательную среду. Культуры высевали на питательную среду для получения гигантских колоний. Чашки выдерживали в термостате при 28–300С для мезофильных и 38–400С для термофильных культур в течение 5–7 суток, учитывали и отбирали культуры, вокруг колоний которых образовывались непрозрачные зоны гидролиза жиров. Активными считали культуры, образующие зоны, превышающие диаметр колоний. Для количественного определения липазной активности грибы выращивали в глубинных условиях в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл питательной среды на круговой качалке (150 об/мин) в течение 3–4 суток при 36–400С. Посевным материалом для иннокуляции питательной среды служила суспензия спор гриба. Липазную активность определяли в фильтрате культуральной жидкости. За единицу липазной активности принимали такое количество фермента, которое освобождает 1 мкМ олеиновой кислоты из 40% эмульсии оливкового масла в 10% растворе поливинилового спирта за 1 ч в условиях опыта.

При глубинных условиях выращивания липазную активность культур выявляли на различных питательных средах (%):

1) видоизмененная среда Чапека:

а) KH2PO4 – 0,1; MgSO4*7H20 – 0,05; FeSO4 *7H20–0,01; CaCO3-0,3; хлопковое масло и пептон – по 0,1;

б) минеральный состав с добавлением хлопкового масла и кукурузного экстракта по 1,0;

2) среда из 7% экстракта солодовых ростков с добавлением (NH4)2SO4 – 0,3; CaCO3 – 0,1 и хлопкового масла – 1,0;

3) среда с гидролизатом БВК -1,0; (NH4)2SO4 – 0,3; CaCO3 и хлопковое масло – по 0,1; рН питательных сред – 6,5–7,0.

Внутриклеточную липазную активность определяли в гомогенате сырой биомассы. Для этого 0,5 г биомассы, тщательно отмытой дистиллированной воды, растирали в фарфоровой ступке с кварцевым песком, доводили объем до 50 мл дистиллированной воды и выдерживали 2 ч при комнатной температуре, затем отфильтровывали через бумажный фильтр и фильтрат использовали для анализа. Активность рассчитывали на 1 г абсолютно сухой биомассы /46/.

Другой способ биосинтеза липазы заключается в следующем. Сначала была получена культура дрожжей Candida paralipolytica 739. Работа началась с использования питательной среды следующего состава (%): (NH4)2SO4 – 0,3; MgSO4 – 0,07; NaCl – 0,05; Ca(NO3)2 – 0,04; KH2PO4 – 1,0; K2HPO4 – 0,1; глюкоза – 0,5; дрожжевой автолизат – 0,1 (по сухому веществу). В качестве посевного материала использовали 48-часовую культуру, выращенную на косом агаре. Для опытов культуру дрожжей выращивали при 300С в колбах емкостью 750 мл со 100 мл среды на качалке при 240–250 об/мин в течение 2-х суток. Липазную активность в культуральной жидкости определяли по количеству олеиновой кислоты, образовавшейся в результате действия фермента на оливковое масло. В международной практике эмульсию оливкового масла в поливиниловом спирте в качестве субстрата используют для определения липазной активности и, в частности, для экзолипазы дрожжевой культуры Candida paralipolytica /47/. В данном опыте реакционная смесь содержала 2,5 мл 40%-ной эмульсии оливкового масла в 2%-ном поливиниловом спирте, 2 мл 1/15 М фосфатного буфера с рН 8 и 0,5 мл ферментного раствора. Реакцию проводили при 370С в течение 1 ч и прерывали добавлением 15 мл этанола. Полученную смесь титровали 0,05 н. NaOH в присутствии индикатора тимолового синего. Контрольные образцы обрабатывали так же, но без предварительной инкубации и немедленно оттитровывали. Результаты титрования определяли по разности между контролем и опытом. За единицу активности принимали количество, способное высвобождаться 1 мк/моль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 8,0 и температуре 370 в течение 1 ч /48/.

Страницы: 1 2


Другое по теме:

Ход работы
Работа включает несколько этапов Получение вытяжки пигментов – отцентрифугировали культуру водорослей, объемом 150 мл, при 5 тыс/об в минуту, осадок аккуратно перенесли в ступку, добавили немного песка и растворителя (смесь спирта и ацет ...

Высококонцентрированные эмульсии
В большинстве эмульсий, предназначенных для технологического применения, концентрация дисперсной фазы составляет 25-50%. Вязкость таких эмульсий практически не отличается от вязкости дисперсионной среды. Поскольку высокая вязкость дисперс ...

Питекантроп
Впервые ископаемые остатки древнейших людей, получивших название архантропов, были обнаружены голландцем Е.Дюбуа на о. Ява в 1890 году. Но лишь в 1949 году, благодаря находке близ Пекина, 40 индивидуумов древнейших людей вместе с их кам ...