Определение активности глутатионпероксидазы

Принцип метода: определение активности глутатионредуктазы основано на измерении скорости окисления NADPH, которая регистрируется спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при длине волны 340 нм .

Для определения активности глутатионредуктазы использовали осмотический гемолизат, приготовленный следующим образом. К одному объему упакованных и отмытых от плазмы эритроцитов добавляли девяти кратный объем холодной дистиллированной воды.

Ход определения:

В спектрофотометрическую кювету с расстоянием между рабочими гранями 10 мм последовательно вносят 2,7 мл калий-фосфатного буфера, 0,1 мл раствора NADPH, 0,1 мл гемолизата и 0,1 мл раствора GSSG. Реакция запускается добавлением в пробу окисленного глутатиона. Смесь перемешивают. Изменеие оптической плотности регистрируют через 1 минуту в течение 3 минут против пробы, содержащей все компоненты, кроме GSSG.

Реактивы:

1. 50 мМ калий-фосфатный буфер , рН 7,0, содержащий 1мМ EDTA;

2. 0,1 мМ раствор NADPH;

3, 0,5 мМ раствор окисленного глутатиона (хранят в замороженном виде).

Активность фермента выражают в мкмолях ¤г Hb в минуту. Расчет производят по формуле:

,

где:

А – активность глутатионредуктазы;

DЕ – изменение оптической плотности;

К – коэффициент, учитывающий разведение эритроцитов в реакционной пробе, равный 300;

6,22 – коэффициент экстинкции для NADPH в см-1/мМ-1, при длине волны 340 нм;

t – время наблюдения, мин;

d – расстояние между рабочими гранями кюветы (10 мм);

Hb – гемоглобин в г/л.


Другое по теме:

Стадность у приматов
Приматы - животные публичные. Отдельные их особи традиционно входят в состав семейных групп и более широких стад. Групповой, либо стадный, стиль жизни у высших приматов (т. е. над уровнем полуобезьян) определяется 2-мя критериями. У широ ...

Белый гусь (Сhen hyperboreus)
Гусь снежно-белой с черными вершинами крыльев, образованными чёрными первостепенными маховыми перьями. Клюв и лапы красноватые. Длина тела 580-730 мм, вес 2,0- 2,2 кг. Распространен преимущественно в Северной Америке от мыса. Барроу на ...

Мезозой
Окончательно Пангея оформляется к рубежу новой геологической эры – мезозойской, начавшейся около 235 млн. лет назад. Та делится на три периода – триасовый, юрский и меловой. В мезозое происходит распад Пангеи на два суперматерика – северн ...