Определение активности глутатионпероксидазы

Принцип метода: определение активности глутатионредуктазы основано на измерении скорости окисления NADPH, которая регистрируется спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при длине волны 340 нм .

Для определения активности глутатионредуктазы использовали осмотический гемолизат, приготовленный следующим образом. К одному объему упакованных и отмытых от плазмы эритроцитов добавляли девяти кратный объем холодной дистиллированной воды.

Ход определения:

В спектрофотометрическую кювету с расстоянием между рабочими гранями 10 мм последовательно вносят 2,7 мл калий-фосфатного буфера, 0,1 мл раствора NADPH, 0,1 мл гемолизата и 0,1 мл раствора GSSG. Реакция запускается добавлением в пробу окисленного глутатиона. Смесь перемешивают. Изменеие оптической плотности регистрируют через 1 минуту в течение 3 минут против пробы, содержащей все компоненты, кроме GSSG.

Реактивы:

1. 50 мМ калий-фосфатный буфер , рН 7,0, содержащий 1мМ EDTA;

2. 0,1 мМ раствор NADPH;

3, 0,5 мМ раствор окисленного глутатиона (хранят в замороженном виде).

Активность фермента выражают в мкмолях ¤г Hb в минуту. Расчет производят по формуле:

,

где:

А – активность глутатионредуктазы;

DЕ – изменение оптической плотности;

К – коэффициент, учитывающий разведение эритроцитов в реакционной пробе, равный 300;

6,22 – коэффициент экстинкции для NADPH в см-1/мМ-1, при длине волны 340 нм;

t – время наблюдения, мин;

d – расстояние между рабочими гранями кюветы (10 мм);

Hb – гемоглобин в г/л.


Другое по теме:

Внешний вид
Тело крокодилов ящерицеобразное, длиной 2–7 м, голова уплощенная с длинной мордой. Глаза и ноздри сильно выступают над головой. В полости рта развито вторичное небо. Зубы текодонтные, язык приращен к дну ротовой полости. Зубы у крокодилов ...

Экологическая система и потоки энергии и вещества в ней. Трофические сети и цепи.
Понятия экологической системы и биогеоценоза Термин «экологическая система» в 1935 г. предложил английский ученый А Тэнсли. Экологическая система, или экосистема (греч. oikos — жилище, дом и systema — сочетание, объединение) — это сово ...

Динамический хаос - фундаментальное свойство реальности
И.Пригожин: В течение всей моей научной карьеры меня чрезвычайно интересовала проблема времени, точнее, то, что я предпочитаю называть парадоксом времени. С одной стороны, различие между прошлым и будущим весьма важно для нашего существ ...