Принцип метода: определение активности глутатионредуктазы основано на измерении скорости окисления NADPH, которая регистрируется спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при длине волны 340 нм .

Для определения активности глутатионредуктазы использовали осмотический гемолизат, приготовленный следующим образом. К одному объему упакованных и отмытых от плазмы эритроцитов добавляли девяти кратный объем холодной дистиллированной воды.

Ход определения:

В спектрофотометрическую кювету с расстоянием между рабочими гранями 10 мм последовательно вносят 2,7 мл калий-фосфатного буфера, 0,1 мл раствора NADPH, 0,1 мл гемолизата и 0,1 мл раствора GSSG. Реакция запускается добавлением в пробу окисленного глутатиона. Смесь перемешивают. Изменеие оптической плотности регистрируют через 1 минуту в течение 3 минут против пробы, содержащей все компоненты, кроме GSSG.

Реактивы:

1. 50 мМ калий-фосфатный буфер , рН 7,0, содержащий 1мМ EDTA;

2. 0,1 мМ раствор NADPH;

3, 0,5 мМ раствор окисленного глутатиона (хранят в замороженном виде).

Активность фермента выражают в мкмолях ¤г Hb в минуту. Расчет производят по формуле:

,

где:

А – активность глутатионредуктазы;

DЕ – изменение оптической плотности;

К – коэффициент, учитывающий разведение эритроцитов в реакционной пробе, равный 300;

6,22 – коэффициент экстинкции для NADPH в см-1/мМ-1, при длине волны 340 нм;

t – время наблюдения, мин;

d – расстояние между рабочими гранями кюветы (10 мм);

Hb – гемоглобин в г/л.

Другое по теме:

Волновая и электромагнитная теории света, понятие об эфире
Максвелл считал, что одной из частных разновидностей электромагнитных волн являются световые волны. Скорость света была измерена достаточно точно французом Физо в 1848 г. Она оказалась очень большой – около 300 000 км/сек, но конечной. Сл ...

Классификация ЭЧ
К настоящему времени число зарегистрированных частиц и античастиц приближается к четырём сотням. Существует две относительно смежные классификации элементарных частиц. Во-первых, это деление частиц на фермионы (частицы вещества) и бозоны ...

Особенности строения грибов
Вегетативное тело гриба представлено мицелием (или грибницей)- Системой тонких ветвящихся нитей (гиф), характеризующихся верхушечным ростом и выраженным боковым ветвлением. Часть грибницы расположена в почве, носит название почвенной (и ...