Определение активности глутатионпероксидазы

Принцип метода: определение активности глутатионредуктазы основано на измерении скорости окисления NADPH, которая регистрируется спектрофотометрически по уменьшению оптической плотности при длине волны 340 нм .

Для определения активности глутатионредуктазы использовали осмотический гемолизат, приготовленный следующим образом. К одному объему упакованных и отмытых от плазмы эритроцитов добавляли девяти кратный объем холодной дистиллированной воды.

Ход определения:

В спектрофотометрическую кювету с расстоянием между рабочими гранями 10 мм последовательно вносят 2,7 мл калий-фосфатного буфера, 0,1 мл раствора NADPH, 0,1 мл гемолизата и 0,1 мл раствора GSSG. Реакция запускается добавлением в пробу окисленного глутатиона. Смесь перемешивают. Изменеие оптической плотности регистрируют через 1 минуту в течение 3 минут против пробы, содержащей все компоненты, кроме GSSG.

Реактивы:

1. 50 мМ калий-фосфатный буфер , рН 7,0, содержащий 1мМ EDTA;

2. 0,1 мМ раствор NADPH;

3, 0,5 мМ раствор окисленного глутатиона (хранят в замороженном виде).

Активность фермента выражают в мкмолях ¤г Hb в минуту. Расчет производят по формуле:

,

где:

А – активность глутатионредуктазы;

DЕ – изменение оптической плотности;

К – коэффициент, учитывающий разведение эритроцитов в реакционной пробе, равный 300;

6,22 – коэффициент экстинкции для NADPH в см-1/мМ-1, при длине волны 340 нм;

t – время наблюдения, мин;

d – расстояние между рабочими гранями кюветы (10 мм);

Hb – гемоглобин в г/л.


Другое по теме:

Преимущества и перспективы системного метода
Обратимся теперь к вопросу о преимуществах и перспективах системного метода исследования. Прежде всего, заметим, что возникновение самого системного метода и его применение в естествознании и других науках знаменуют значительно возросшую ...

Регуляция активности белковых посредников путем пространственного разобщения и взаимодействия с мембранами
Механизмы первого типа более распространены у эукариот в связи с локализацией ферментов в субклеточных органеллах: митохондриях, лизосомах и т.д. Однако и в клетках прокариот возможны определенные виды компартментации: а) часть ферментно ...

Особенности биологической формы организации материи. Молекулы живых систем
Из всех полимерных веществ, существующих в природе и созданных человеком, самые важные - белки и нуклеиновые кислоты, биологические полимеры, макромолекулы. Белки выполняют все жизненно важные функции в организме. Они являются катализато ...