Определение активности глутатион-S-трансферазы

Принцип метода: активность глутатион-S-трансферазы определяли по скорости образования глутатион-S-конъюгатов между GSH и 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ).

Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм (максимум поглощения глутатион -S- ХДНБ) [Habig et al., 1974].

Ход определения

Источником фермента служил осмотический гемолизат, который готовили добавлением к одному объему упакованных эритроцитов двадцати объемов дист. Н2О, охлажденной до 0°С. В кювету с длиной оптического пути 1,0 см, содержащую 2,5 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера рН=6,5, добавляли 0,2 мл 0,015 М раствора восстановленного глутатиона и 0,1 мл гемолизата. Реакцию инициировали внесением в кювету 0,2 мл 0,015М ХДНБ (готовили на абсолютном метаноле). Параллельно опытной готовили контрольную пробу, в которую вместо гемолизата вносили дист. Н2О. Регистрацию оптической плотности проводили при t=25°C и длине волны 340 нм против воды сразу после перемешивания в течение трех минут. Активность фермента рассчитывали, используя коэффициент экстинкции для ГS-ХДНБ при длине волны 340 нм, равный 9,6 мМ-1*см-1, и выражали в ммолях образующихся глутатион S-конъюгатов в минуту на грамм Hb.

Реактивы:

1. 0.1М калий – фосфатный буфер РН6,5;

2. 0.015М раствор GSН;

3. 0.015М раствор ХДНБ.

Активность GPO рассчитывают по следующей формуле:

где:

А – активность фермента, моль\мин×Hb

∆E – изменение оптической плотности в мин.

d – толщена кюветы (1см)

f – коэффициент разведения эритроцитов в пробе

ε – коэффициент молярной экстинкции при χ=340нм (9600М-1×см-1)

Hb – гемоглобин г/л

1000 – коэффициент для пересчета активности GST от молярной к миллимолярной;

Vпр. – объем пробы, используемый для определения активности GST

Vр.с - объем реакционной смеси;


Другое по теме:

Эволюция приматов
Данные молекулярной биологии оказали существенную помощь в реставрации родословного дерева приматов. В итоге предстоящего проведения работ в Африке, на местности Кении и Уганды, найдено около 1000 ископаемых приматов древностью 22-17 млн ...

Палеоантроп
О культуре палеоантропа мы имеем возможность судить по многочисленным мустьерским стоянкам. Мустьерская культура по отношению к предыдущей была более совершенной как по технике обработки и использовании орудий, так и по разнообразию их фо ...

Значение света для распределения растений.
Нет почти такого уголка на земной поверхности, где бы, благодаря недостатку освещения, растительная жизнь была невозможна, так как, если освещение слишком слабо в известное время года (напр., во время полярных ночей), то в другое время он ...