Определение активности глутатион-S-трансферазы

Принцип метода: активность глутатион-S-трансферазы определяли по скорости образования глутатион-S-конъюгатов между GSH и 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ).

Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм (максимум поглощения глутатион -S- ХДНБ) [Habig et al., 1974].

Ход определения

Источником фермента служил осмотический гемолизат, который готовили добавлением к одному объему упакованных эритроцитов двадцати объемов дист. Н2О, охлажденной до 0°С. В кювету с длиной оптического пути 1,0 см, содержащую 2,5 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера рН=6,5, добавляли 0,2 мл 0,015 М раствора восстановленного глутатиона и 0,1 мл гемолизата. Реакцию инициировали внесением в кювету 0,2 мл 0,015М ХДНБ (готовили на абсолютном метаноле). Параллельно опытной готовили контрольную пробу, в которую вместо гемолизата вносили дист. Н2О. Регистрацию оптической плотности проводили при t=25°C и длине волны 340 нм против воды сразу после перемешивания в течение трех минут. Активность фермента рассчитывали, используя коэффициент экстинкции для ГS-ХДНБ при длине волны 340 нм, равный 9,6 мМ-1*см-1, и выражали в ммолях образующихся глутатион S-конъюгатов в минуту на грамм Hb.

Реактивы:

1. 0.1М калий – фосфатный буфер РН6,5;

2. 0.015М раствор GSН;

3. 0.015М раствор ХДНБ.

Активность GPO рассчитывают по следующей формуле:

где:

А – активность фермента, моль\мин×Hb

∆E – изменение оптической плотности в мин.

d – толщена кюветы (1см)

f – коэффициент разведения эритроцитов в пробе

ε – коэффициент молярной экстинкции при χ=340нм (9600М-1×см-1)

Hb – гемоглобин г/л

1000 – коэффициент для пересчета активности GST от молярной к миллимолярной;

Vпр. – объем пробы, используемый для определения активности GST

Vр.с - объем реакционной смеси;


Другое по теме:

Молчаливые охотники
Большинство змей располагают единственным оружием - челюстями и зубами. К добыче подкрадываются различными способами. Случается, что змея лежа поджидает жертву, но нападает всегда броском. С виду все это происходит очень быстро, но опыты ...

Расчет мощности хозяйства по хищнику
Естественная рыбопродуктивность нагульных прудов по двухлеткам карпа составляет 1350 кг / га. 1. Мощность хозяйства по хищнику: Nx = Пх * Sраб наг. Sраб наг. = m1 * А1 / 1350 = 0,4 * 1,7 / 1350 = 504 га Nx = 30 * 504 = 15120 ...

Четвертая научная революция
Еще в конце XIX века большинство ученых склонялись к точке зрения, что физическая картина мира в основном построена и останется в дальнейшем незыблемой. Предстоит уточнять лишь детали. Но в первые десятилетия XX века физические воззрения ...