Определение активности глутатион-S-трансферазы

Принцип метода: активность глутатион-S-трансферазы определяли по скорости образования глутатион-S-конъюгатов между GSH и 1-хлор-2,4-динитробензолом (ХДНБ).

Увеличение концентрации конъюгатов в ходе реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 340 нм (максимум поглощения глутатион -S- ХДНБ) [Habig et al., 1974].

Ход определения

Источником фермента служил осмотический гемолизат, который готовили добавлением к одному объему упакованных эритроцитов двадцати объемов дист. Н2О, охлажденной до 0°С. В кювету с длиной оптического пути 1,0 см, содержащую 2,5 мл 0,1 М калий-фосфатного буфера рН=6,5, добавляли 0,2 мл 0,015 М раствора восстановленного глутатиона и 0,1 мл гемолизата. Реакцию инициировали внесением в кювету 0,2 мл 0,015М ХДНБ (готовили на абсолютном метаноле). Параллельно опытной готовили контрольную пробу, в которую вместо гемолизата вносили дист. Н2О. Регистрацию оптической плотности проводили при t=25°C и длине волны 340 нм против воды сразу после перемешивания в течение трех минут. Активность фермента рассчитывали, используя коэффициент экстинкции для ГS-ХДНБ при длине волны 340 нм, равный 9,6 мМ-1*см-1, и выражали в ммолях образующихся глутатион S-конъюгатов в минуту на грамм Hb.

Реактивы:

1. 0.1М калий – фосфатный буфер РН6,5;

2. 0.015М раствор GSН;

3. 0.015М раствор ХДНБ.

Активность GPO рассчитывают по следующей формуле:

где:

А – активность фермента, моль\мин×Hb

∆E – изменение оптической плотности в мин.

d – толщена кюветы (1см)

f – коэффициент разведения эритроцитов в пробе

ε – коэффициент молярной экстинкции при χ=340нм (9600М-1×см-1)

Hb – гемоглобин г/л

1000 – коэффициент для пересчета активности GST от молярной к миллимолярной;

Vпр. – объем пробы, используемый для определения активности GST

Vр.с - объем реакционной смеси;


Другое по теме:

Получение и осеменение икры карпа
Получать половые продукты начинают через 18-20 часов после разрешающей инъекции. За 30-40 мин до получения икры отцеживают молоки самцов в сухие бюксы, закрывают их крышками и хранят в темноте в термосе со льдом или в холодильнике. Икру о ...

Эволюция приматов
Данные молекулярной биологии оказали существенную помощь в реставрации родословного дерева приматов. В итоге предстоящего проведения работ в Африке, на местности Кении и Уганды, найдено около 1000 ископаемых приматов древностью 22-17 млн ...

Функции биологических мембран. Трансмембранный перенос малых молекул: диффузия (пассивная и облегченная) и активный транспорт
Фосфолипидный бислой, как уже было сказано, составляет основу структуры мембраны. Он также ограничивает проникновение полярных молекул и ионов в клетку и выход их из нее. Ряд функций выполняют и другие компоненты мембран. 1. Белки-каналы ...