Определение активности глутатионпероксидазы

Принцип метода:

глутатионпероксидаза катализирует реакцию взаимодействия GSH с гидроперекисью трет-бутила (ГПТБ). Активность фермента при этом может быть оценена по изменению содержания GSH в пробах до, и после инкубации с модельным субстратом в ходе цветной реакции с ДТНБК [Paglia, Valentine, 1967].

Ход определения

Отмытые и упакованные эритроциты гемолизировали охлаждённой до 0ºС водой в соотношении 1:200. 0,2 мл гемолизата смешивали с 0,73 мл сложного буфера и термостатировали 10 мин при 37°С. Реакцию инициировали внесением в реакционную смесь 0,07 мл 0,14%-ного раствора ГПТБ (коммерческий препарат). Строго по секундомеру через 5 мин инкубации при 37°С реакцию останавливали добавлением 0,2 мл 20%-ного раствора ТХУ. В контрольные пробы 0,14%-ный раствор ГПТБ вносили после осаждения белка ТХУ. Полученные пробы центрифугировали при 1700g в течение 10 мин. Супернатант использовали для определения количества восстановленного глутатиона: к 0,1 мл супернатанта добавляли 2,65 мл 0,1 М трис-HCl буфера. После перемешивания пробы фотометрировали на СФ-26 при длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против дист. Н2О. Активность фермента в эритроцитах выражали в мкмолях GSH, окисленного за 1 минуту на грамм Hb, используя коэффициент молярной экстинкции (13600 М-1´см-1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК.

Реактивы:

1. Сложный буфер: 0,1М Трис-HCl-буфер, pH8,5, содержащий 6мМ ЭДТА и 12мМ азид натрия. Непосредственно на этом буфере готовят 4,8 мМ раствор GSH

2. 0,14%-ный раствор трет-бутил гидропероксида

3. 20%-ный раствор ТХУ

4. 0,1 М трис-HCl буфер, pH8,5

5. ДТНБК на абсолютном метаноле, 0,01М

Активность рассчитывают по формуле:

,

где:

А - активность фермента, мкмоль/мин×л;

∆С – разность концентраций GSH в опытной и контрольной пробах;

Vпр. – объем пробы, используемый для определения концентрации GPO

t – время инкубации;

Vр.с - объем реакционной смеси;

201 – степень разведения эритроцитов в гемолизате;

1000 – коэффициент для пересчета активности GPO от молярной к миллимолярной;

Hb – гемоглобин г/л;

Активность GPO можно также выразить в мкмоль\мин на 1 г Hb


Другое по теме:

Определение колористических показателей волосяного покрова
Колористические показатели волосяного покрова определяются на приборе «Пульсар». Образцы тщательно расчесываются, накрывают стеклом и фотографируют. Далее работают при установлении кнопки «режим» - 3. Предварительно прибор прогревают в т ...

Способы деления клеток. Сходства и различия митотического, редукционного и эквационного деления клетки. Приведите примеры клеток, размножающихся посредством указанных видов деления
Деление клеток - основа размножения и индивидуального развития организмов. Жизненный цикл клетки. Митотический цикл клетки, митоз (амитоз). Жизнь клетки завершается делением или, как у многоклеточных организмов, старением и смертью. Толь ...

Животные корма
Мясо моллюсков 10 39,6 4,1 33,8 12,5 1:0,2 Мясная мука 10,8 72,2 13,2 3,8 1:0,1 Рыбная мука 10,7 59,5 6,4 23,4 1:2 Куколка тутово-го шелкопряда 54,3 22,7 ...