Определение активности глутатионпероксидазы

Принцип метода:

глутатионпероксидаза катализирует реакцию взаимодействия GSH с гидроперекисью трет-бутила (ГПТБ). Активность фермента при этом может быть оценена по изменению содержания GSH в пробах до, и после инкубации с модельным субстратом в ходе цветной реакции с ДТНБК [Paglia, Valentine, 1967].

Ход определения

Отмытые и упакованные эритроциты гемолизировали охлаждённой до 0ºС водой в соотношении 1:200. 0,2 мл гемолизата смешивали с 0,73 мл сложного буфера и термостатировали 10 мин при 37°С. Реакцию инициировали внесением в реакционную смесь 0,07 мл 0,14%-ного раствора ГПТБ (коммерческий препарат). Строго по секундомеру через 5 мин инкубации при 37°С реакцию останавливали добавлением 0,2 мл 20%-ного раствора ТХУ. В контрольные пробы 0,14%-ный раствор ГПТБ вносили после осаждения белка ТХУ. Полученные пробы центрифугировали при 1700g в течение 10 мин. Супернатант использовали для определения количества восстановленного глутатиона: к 0,1 мл супернатанта добавляли 2,65 мл 0,1 М трис-HCl буфера. После перемешивания пробы фотометрировали на СФ-26 при длине волны 412 нм в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против дист. Н2О. Активность фермента в эритроцитах выражали в мкмолях GSH, окисленного за 1 минуту на грамм Hb, используя коэффициент молярной экстинкции (13600 М-1´см-1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК.

Реактивы:

1. Сложный буфер: 0,1М Трис-HCl-буфер, pH8,5, содержащий 6мМ ЭДТА и 12мМ азид натрия. Непосредственно на этом буфере готовят 4,8 мМ раствор GSH

2. 0,14%-ный раствор трет-бутил гидропероксида

3. 20%-ный раствор ТХУ

4. 0,1 М трис-HCl буфер, pH8,5

5. ДТНБК на абсолютном метаноле, 0,01М

Активность рассчитывают по формуле:

,

где:

А - активность фермента, мкмоль/мин×л;

∆С – разность концентраций GSH в опытной и контрольной пробах;

Vпр. – объем пробы, используемый для определения концентрации GPO

t – время инкубации;

Vр.с - объем реакционной смеси;

201 – степень разведения эритроцитов в гемолизате;

1000 – коэффициент для пересчета активности GPO от молярной к миллимолярной;

Hb – гемоглобин г/л;

Активность GPO можно также выразить в мкмоль\мин на 1 г Hb


Другое по теме:

Проблемы микробиологической безопасности и адаптация микроорганизмов в космических условиях
Развитие отечественной космонавтики за последние десятилетия ознаменовалось весьма существенными результатами. Одним из основных итогов в этой области является создание и длительное функционирование орбитальных космических станций. Освоен ...

Атомизм в химии XIX в.
Атомная теория впервые возникает в Древней Греции. Её прародителями являются Левкипп и Демокрит. До нас не дошло ни строчки их трудов, известны только комментарии их учения. По этим комментариям мы знаем основной тезис первых атомистов – ...

Человек: организм и личность
Аристотель (384-322 до РХ) впервые подробно рассмотрел человеческое тело, указал место, занимаемое человеком в системе животного мира и отметил такие кардинальные различия между человеком и животными, как прямохождение, крупный головной м ...