Определение количества восстановленного глутатиона

Принцип метода

основан на взаимодействии GSH с ДТНБК (5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2-нитро-5-тиобензоата. Увеличение концентрации желтого аниона в ходе данной реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 412 нм [Beutler, 1990].

Ход определения

Готовим гемолизат добавлением 0,2 мл отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов к 1,8 мл дист. Н2О, охлаждённой до 0ºС. Для осаждения белков к гемолизату добавляли 3 мл осаждающего раствора. Пробы тщательно перемешивали и после 20 минутного стояния при комнатной температуре фильтровали через крупнопористый фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным и бесцветным. 1 мл фильтрата помещали в спектрофотометрическую кювету объёмом 3 мл, добавляли 4 мл фосфатного буфера. Затем в пробу вносили 500 мкл раствора ДТНБК. Сразу же после перемешивания должна появиться жёлтая окраска из-за образования дисульфида глутатиона с ДТНБК. Пробу фотометрировали при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Поскольку раствор ДТНБК имеет слабожелтую окраску, параллельно с опытной пробой готовили контрольную, содержащую вместо фильтрата осаждающий раствор, разведённый дист. Н2О в отношении 2:5.

Реактивы:

1. Осаждающий раствор: 1,67 г ледяной ортофосфорной кислоты, 0,2 г ЭДТА и 30 г хлористого натрия растворяли в дист. Н2О и доводили до метки 100 мл.

2. Фосфатный буфер: 0,3 М Na2HPO4

3. ДТНБК: 0,02%-ный раствор, приготовленный на 1%-ном растворе цитрата натрия

Содержание восстановленного глутатиона рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции (13600 М-1´см-1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК и выражали в мкмоль на грамм Hb.

Содержание глутатиона рассчитывают по формуле:

,

где:

С – концентрация восстановленного глутатиона, мкмоль/г Hb;

Е1 – оптическая плотность опытной пробы до добавления ДТНБК;

Е2 – оптическая плотность опытной пробы после добавления ДТНБК;

138 – разведение эритроцитов в реакционной пробе;

Hb – гемоглобин, г/л;

1000 – коэффициент для пересчета концентрации глутатиона от молярной к миллимолярной;

F – отношение оптической плотности контрольной пробы до добавления ДТНБК (Е1 ) и после добавления (Е2 );

13600 – коэффициент молярной экстинции окрашенного катиона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК;


Другое по теме:

Тепловое равновесие и флуктуации. Неравновесные состояния и релаксация
Релаксация - процесс установления термодинамического равновесия в макроскопической физической системе. Под временем релаксации разумеют время установления равновесия в системе. Время релаксации существенно зависит от размеров системы, а и ...

Общая топография внутренних органов
После знакомства с общим расположением внутренних органов (рис. 3), приступайте к последовательному рассмотрению отдельных систем в порядке, изложенном ниже. Кровеносная система. Сердце (cor, рис. 2) млекопитающих находится в переднем от ...

Предельно допустимые уровни шума
Шум имеет определенную частоту, или спектр, выражаемый в герцах, и интенсивность – уровень звукового давления, измеряемый в децибелах. Для человека область слышимых звуков определяется в интервале от 16 до 20 000 Гц. Наиболее чувствителен ...