Принцип метода
основан на взаимодействии GSH с ДТНБК (5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2-нитро-5-тиобензоата. Увеличение концентрации желтого аниона в ходе данной реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 412 нм [Beutler, 1990].
Ход определения
Готовим гемолизат добавлением 0,2 мл отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов к 1,8 мл дист. Н2О, охлаждённой до 0ºС. Для осаждения белков к гемолизату добавляли 3 мл осаждающего раствора. Пробы тщательно перемешивали и после 20 минутного стояния при комнатной температуре фильтровали через крупнопористый фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным и бесцветным. 1 мл фильтрата помещали в спектрофотометрическую кювету объёмом 3 мл, добавляли 4 мл фосфатного буфера. Затем в пробу вносили 500 мкл раствора ДТНБК. Сразу же после перемешивания должна появиться жёлтая окраска из-за образования дисульфида глутатиона с ДТНБК. Пробу фотометрировали при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Поскольку раствор ДТНБК имеет слабожелтую окраску, параллельно с опытной пробой готовили контрольную, содержащую вместо фильтрата осаждающий раствор, разведённый дист. Н2О в отношении 2:5.
Реактивы:
1. Осаждающий раствор: 1,67 г ледяной ортофосфорной кислоты, 0,2 г ЭДТА и 30 г хлористого натрия растворяли в дист. Н2О и доводили до метки 100 мл.
2. Фосфатный буфер: 0,3 М Na2HPO4
3. ДТНБК: 0,02%-ный раствор, приготовленный на 1%-ном растворе цитрата натрия
Содержание восстановленного глутатиона рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции (13600 М-1´см-1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК и выражали в мкмоль на грамм Hb.
Содержание глутатиона рассчитывают по формуле:
,
где:
С – концентрация восстановленного глутатиона, мкмоль/г Hb;
Е1 – оптическая плотность опытной пробы до добавления ДТНБК;
Е2 – оптическая плотность опытной пробы после добавления ДТНБК;
138 – разведение эритроцитов в реакционной пробе;
Hb – гемоглобин, г/л;
1000 – коэффициент для пересчета концентрации глутатиона от молярной к миллимолярной;
F – отношение оптической плотности контрольной пробы до добавления ДТНБК (Е1 ) и после добавления (Е2 );
13600 – коэффициент молярной экстинции окрашенного катиона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК;
Другое по теме:
Накопление рецепторов к ацетилхолину
Исследования Фишбаха, Кохена, Шанге, Салпетера, Штайнбаха, Пу, Кидокоро и других показали, что на ранних периодах развития рецепторы АХ распределены диффузно вдоль поверхности неиннервированных мышечных волокон с плотностью около нескольк ...
Эволюция эукариотического генома
В отличие от изменений прокариотического генома преобразования генома в эволюции эукариот связаны с нарастающим увеличением количества ДНК. Это увеличение наблюдается в процессе прогрессивной эволюции эукариот. На фоне такого увеличения б ...
Пчелиная семья как сообщество
Больше всего рабочих пчел бывает в семьях в середине летнего сезона, когда цветут основные медоносные растения, дающие насекомым корм. В это время в каждой сильной семье насчитывается 50—60 тыс. и более рабочих пчел (5—6 кг), а ранней вес ...