Определение количества восстановленного глутатиона

Принцип метода

основан на взаимодействии GSH с ДТНБК (5,5’-дитио-бис-2-нитробензойной кислотой) с образованием окрашенного в желтый цвет аниона 2-нитро-5-тиобензоата. Увеличение концентрации желтого аниона в ходе данной реакции регистрировали спектрофотометрически при длине волны 412 нм [Beutler, 1990].

Ход определения

Готовим гемолизат добавлением 0,2 мл отмытых от плазмы и упакованных эритроцитов к 1,8 мл дист. Н2О, охлаждённой до 0ºС. Для осаждения белков к гемолизату добавляли 3 мл осаждающего раствора. Пробы тщательно перемешивали и после 20 минутного стояния при комнатной температуре фильтровали через крупнопористый фильтр. Фильтрат должен быть прозрачным и бесцветным. 1 мл фильтрата помещали в спектрофотометрическую кювету объёмом 3 мл, добавляли 4 мл фосфатного буфера. Затем в пробу вносили 500 мкл раствора ДТНБК. Сразу же после перемешивания должна появиться жёлтая окраска из-за образования дисульфида глутатиона с ДТНБК. Пробу фотометрировали при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 1,0 см. Поскольку раствор ДТНБК имеет слабожелтую окраску, параллельно с опытной пробой готовили контрольную, содержащую вместо фильтрата осаждающий раствор, разведённый дист. Н2О в отношении 2:5.

Реактивы:

1. Осаждающий раствор: 1,67 г ледяной ортофосфорной кислоты, 0,2 г ЭДТА и 30 г хлористого натрия растворяли в дист. Н2О и доводили до метки 100 мл.

2. Фосфатный буфер: 0,3 М Na2HPO4

3. ДТНБК: 0,02%-ный раствор, приготовленный на 1%-ном растворе цитрата натрия

Содержание восстановленного глутатиона рассчитывали с учетом коэффициента молярной экстинкции (13600 М-1´см-1) окрашенного аниона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК и выражали в мкмоль на грамм Hb.

Содержание глутатиона рассчитывают по формуле:

,

где:

С – концентрация восстановленного глутатиона, мкмоль/г Hb;

Е1 – оптическая плотность опытной пробы до добавления ДТНБК;

Е2 – оптическая плотность опытной пробы после добавления ДТНБК;

138 – разведение эритроцитов в реакционной пробе;

Hb – гемоглобин, г/л;

1000 – коэффициент для пересчета концентрации глутатиона от молярной к миллимолярной;

F – отношение оптической плотности контрольной пробы до добавления ДТНБК (Е1 ) и после добавления (Е2 );

13600 – коэффициент молярной экстинции окрашенного катиона, образующегося при взаимодействии GSH с ДТНБК;


Другое по теме:

Экологическое право
Развитие экологической функции государства и права приводит к формированию новой правовой общности, которая получает название экологического права. Исторически система правового регулирования взаимодействия общества и природы подразделяе ...

Участие микроорганизмов в биогеохимических циклах соединений углерода, азота, серы и других элементов
Возможность жизни на нашей планете определяется непрерывно протекающим круговоротом основных биогенных элементов (углерода, кислорода, водорода, азота, фосфора, серы и др.). Ведущая роль в процессах трансформации этих элементов принадлежи ...

Результаты исследований и их обсуждениею Анализ содержания GSH и активности глутатионзависимых ферментов в эритроцитах крови практически здоровых людей и людей с ЛОР-заболеваниями
Воздушные загрязнения играют ключевую роль в развитии окислительного стресса, который является причинной развития патологии дыхательной системы [Менщикова, 2008]. Особое положение, которое занимает эпителий легкого в отношении организма с ...