Современные представления о механизме белкового сплайсинга

Биология » Молекулярные механизмы сплайсинга » Современные представления о механизме белкового сплайсинга

Многими исследователями было показано, что белковый сплайсинг является аутокаталитическим процессом и для своего осуществления не требует присутствия ферментов или кофакторов. Однако определить точный механизм сплайсинга белков долгое время не удавалось — процесс происходит очень быстро, и обычными методами обнаружить промежуточные соединения не представлялось возможным. Главная проблема заключалась в том, что интеин в составе белка нельзя было даже выделить — сплайсинг проходил сразу после синтеза белка, и пока клетки собирались и лизировались — следов уже не оставалось. Решить эту задачу удалось группе Ф. Перлер (Francine Perler) довольно очевидным (как это теперь представляется) способом. Они изменяли ряд консервативных аминокислотных остатков в интеинах методом направленного мутагенеза. Как только мутации касались активного центра интеина — белковый сплайсинг блокировался на разных этапах, и в среде накапливались промежуточные продукты реакции. Например, изменение С-конца интеина вызывало накопление «разветвлённых» белков, у которых было . два N-конца. Исследование этих необычных белков и позволило предложить механизм белкового сплайсинга (см. рис. 3).

Рис. 3. Механизм белкового сплайсинга.

Событием, запускающим белковый сплайсинг, является автокаталитический N–O или N–S-сдвиг (первый аминокислотный остаток на N-конце интеина Ser или Cys, соответственно) на N-концевом сайте сплайсинга (шаг 1). В результате образуется высокореакционная эфирная или тиоэфирная связь.

С точки зрения химии, N–O/N–S-сдвиг не является энергетически выгодным процессом, поскольку в результате реакции происходит разрыв амидной (пептидной) связи и образуется высокоэнергетическая эфирная/тиоэфирная связь. Поэтому этот процесс должен катализироваться. Действительно, протекание реакции разрыва пептидной связи на N-конце облегчается как минимум двумя факторами. Во-первых, процесс катализируется самим сплайсинговым доменом интеина. Во-вторых, на эффективность N-концевого расщепления определенное влияние оказывают экстеины. Показано, что у некоторых интеинов пептидная связь, связывающая N-экстеин и первую аминокислоту интеина, находится в редкой и не характерной для белков цис-конформации. Поскольку такая связь энергетически невыгодна, ее наличие провоцирует протекание N–О или N–S сдвига, т. е. инициирует сплайсинг.

На втором этапе белкового сплайсинга происходит нуклеофильная атака образовавшейся эфирной связи OH- или SH-группой первого остатка С-экстеина. В результате происходит реакция трансэтерификации, т. е. перенос Н-концевого экстеина на боковую группу первого остатка С-экстеина (шаг 2). В результате образуется разветвленное промежуточное соединение (те самые белки с двумя N-концами, с помощью изучения которых был и предложен данный механизм сплайсинга). Такая перестановка приводит к смещению зарядов, что в свою очередь, индуцирует циклизацию боковой цепи Asn на С-конце интеина (шаг 3).

Циклизация боковой группы Asn приводит к разрыву пептидной связи между интеином и С-экстеином — разветвленная структура распадается на свободный интеин и лигированные экстеины, связанные друг с другом эфирной связью (шаг 3). Последний шаг сплайсинга белка происходит спонтанно (шаги 4а и 4б).

Согласно принятой на сегодня теории, белковый сплайсинг состоит из серии последовательных перестановок. Детальными исследованиями этих перестановок занимается российский ученый Старокадомский. Но самое удивительное, что помимо цис-сплайсинга (т. е. автокаталитического удаления интеина из белка-предшественника), у многих организмов обнаружено явление транс-сплайсинга. На пальцах это можно объяснить так: у двух белков на соответствующих концах есть по половинке интеина (назовем их интеин-подобные домены, ИПД), которые, соединяясь по типу «ключ-замок», образуют вполне функциональный интеин. А этот образованный интеин вырезает сам себя, сшивая два белка в единое целое. То есть, в результате транс-сплайсинга происходит сшивание двух белков, кодируемых двумя различными генами (рис. 4). И это не лабораторная экзотика: по такому механизму, например, происходит образование белка DnaE (одна из субъединиц ДНК-полимеразы) у Synechocystis sp.

Рис. 4. Механизм транс-сплайсинга.

Рис. 5. Предполагаемый механизм сплайсинга белков

а, б - альтернативные механизмы инициации сплайсинга, N, C - N- и C- концевые экстеины белков-предшественников


Другое по теме:

Определение концентрации взвешенных веществ
Предварительно готовят фильтры следующим образом: промывают горячей водой (дистиллированной), затем высушивают до постоянного веса в сушильном шкафу при температуре 105оС. Для определения содержания взвешенных веществ их отделяют, фильтр ...

Методика и материалы. Район сбора материала
Исследование проводились на юго-западе Бурейского и Михайловского района Амурской области. Район исследования представляет собой часть юго-восточной территории Зейско - Буреинской равнины. Основная часть территории 65% занята сельскохозяй ...

Методы исследования. Методика приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов
Мясопептонный агар (МПА) При культивировании микроорганизмов большое значение имеет обеспечение их соответствующим питанием. Белковой основой для всех сред является питательный бульон. Основой для приготовления мясопептонного бульона (МП ...