Методы изучения клетки: микроспектромериз, цитофотометрия, флуоресцентная и ультрафиолетовая микроскопия. Метод чисторадиографии
Страница 2

Биология » Цитология и строение клетки » Методы изучения клетки: микроспектромериз, цитофотометрия, флуоресцентная и ультрафиолетовая микроскопия. Метод чисторадиографии

Цитофотометрия

Цитофотометрия - является современной технологией быстрого оптического измерения параметров клетки, ее органелл и происходящих в ней процессов.

Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клеточной стенки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением цитометрии.

Принцип метода. Клеточная суспензия, предварительно меченная флюоресцирующими моноклональными антителами или флуоресцентными красителями, попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку.

Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет т. н. гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

1. рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток).

2. рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/цитоплазма, а так же о неоднородности и гранулярности клеток).

3. интенсивность флуоресценции по 4-ем каналам флуоресцентности (позволяет определить субпопуляционный состав клеточной суспензии и др.)

Наиболее часто используемые флуорохромы

– флуоресцеина изотиоцианат (FITC)

– Фикоэритрин (PE, RD1)

– Перидинин-Хлорофилл Протеин (Per-CP)

– Алофикоцианин (APC)

Тандемные красители:

– Фикоэритрин - Техасский красный (ECD)

– Фикоэритрин - Cy5 (PC5)

– Фикоэритрин - Cy7 (PC7)

Преимущества метода

– короткое время анализа (сек) за счет высокой скорости

– анализ большого количества клеток (до 107 клеток)

– логические ограничения допускают детектирование субпопуляций клеток

– измерение параметров редко встречающихся клеток

– объективное измерение интенсивности флуоресценции

Область применения в цитологии:

1. определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток

2. оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов

3. определение экспрессии поверхностных антигенов

4. анализ стадий клеточного цикла

5. измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный pH, концентрация свободных ионов Ca2+, потенциал наружной клеточной мембраны)

Флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия - высокочувствительный микроскопический метод (анализ проводится как в отраженном, так и в проходящем свете), основанный на обработке тестируемого материала красителями-флуорохромами. Флуоресцирующие (окрашенные) зоны выглядят при флуоресцентной микроскопии как яркие участки на темном фоне.

Основана на способности некоторых веществ люминесцировать, т. е. светиться при освещении невидимым ультрафиолетовым или синим светом. Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса).

При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра.

Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение.

Страницы: 1 2 3 4 5


Другое по теме:

Гибридизация соматических клеток
Следующий метод клеточной селекции–создание неполовых гибридов путем слияния изолированных протопластов, полученных из соматических клеток. Этот метод позволяет скрещивать филогенетически отдаленные виды растений, которые невозможно скрес ...

Современные методы обезжиривания
Обезжиривание — один из основных процессов производства меха. Значение обезжиривания для мехового производства велико: на поверхности волосяного покрова и в кожевой ткани шкурок некоторых видов животных (овец, нутрий, сурков, тюленей, онд ...

Значение света для распределения растений.
Нет почти такого уголка на земной поверхности, где бы, благодаря недостатку освещения, растительная жизнь была невозможна, так как, если освещение слишком слабо в известное время года (напр., во время полярных ночей), то в другое время он ...